如何采用酶标法（ELISA）进行三聚氰胺检测？

　　Thermo MK3型酶标仪

　　本实验方案采用Thermo Scientific的Multiskan MK3型酶标仪和Wellwash 4MK2型洗板机(由北京平利洋公司提供)，，结合Abraxis三聚氰胺检测试剂盒，以竞争法测抗原的原理对液态奶或奶粉中的三聚氰胺进行检测分析。

　　一、样品准备

　　巴氏消毒全脂奶(液体)：

　　1)用稀释液以1:10的比例稀释牛奶样品，如在900 μl的稀释液中加入100 μl牛奶。

　　婴幼儿配方奶粉：

　　1)按照配方奶粉的说明，以稀释液溶解奶粉，如用60 ml稀释液溶解8.6克奶粉。

　　2)用稀释液以1:5的比例稀释奶粉溶液

　　二、样品检测

　　1)试剂使用前，应使其温度恢复至室温(25±2℃)

　　2)吸取100 μl标准品(0, 20, 50, 100, 200和500 ppb)和准备好的样品加入相应的微孔中。然后，每孔再加入50 μl的三聚氰胺HRP酶标记物。

　　3)利用MK3酶标仪的振荡功能，振板60秒，并在室温下孵育30分钟。

　　4)孵育完后，将微孔板转移到Wellwash 4MK2洗板机上进行洗板，每孔加250 μl洗液，洗板四次。

　　5)每孔加入100 μl显色底物溶液，避光孵育20分钟。

　　6)每孔加入100 μl终止液，终止显色反应。

　　7)在MK3酶标仪上读板，测量波长450nm。

　　三、结果分析

　　1)以浓度为0 ppb标准品的吸光值为基准(B0)，归一化标准品的检测吸光值B/B0(B指除B0以外的标准品吸光值)。

　　2)绘制以标准品的B/B0为Y轴坐标、对应的标准品浓度为X轴坐标的散点图。

　　3)对该散点图进行直线拟合。以该拟合曲线的直线方程对待测样品浓度进行计算。

　　4)如果样品吸光值大于最小标样的吸光值，则该样品的浓度<20 ppb;如果样品吸光值小于最大标样的吸光值，则样品的浓度>500 ppb。

　　5)结合稀释倍数，计算最终液态奶或奶粉中的三聚氰胺浓度，如液态奶稀释倍数是10倍。