大叶蛇葡萄有效部位高效液相色谱指纹图谱研究

　　摘要：大叶蛇葡萄A.megalophyllaDielset.Gilg为葡萄科蛇葡萄属植物，味酸涩，性平，具有清热利湿、活血化淤的功能，用于高血压病、痢疾、泄泻、小便淋痛、头昏目胀等治疗。

　　目的建立大叶蛇葡萄AmpelopsismegalophyllaDielset.Gilg有效部位的高效液相色谱(HPLC)指纹图谱，以便完整地反映大叶蛇葡萄有效部位的内在化学信息，为科学评价及有效控制其质量提供可靠方法。方法利用HPLC-DAD方法，梯度洗脱，测定了10批大叶蛇葡萄药材有效部位的样品。色谱条件为：AgilentTCC18分析柱(250mm×4.6mm，5μm)，柱温为30℃;流动相：乙腈-0.1%磷酸水，梯度洗脱，流速为1.0ml/min;检测波长为：250nm。结果建立了大叶蛇葡萄有效部位的HPLC指纹图谱，对10批不同采收时间的大叶蛇葡萄有效部位的样品进行了指纹图谱分析，标定了10个共有指纹峰，通过与对照品的保留时间及紫外光谱比较，1，5，6，9，10号峰分别鉴定为蛇葡萄素、花旗松素、槲皮苷、槲皮素、杨梅素。结论建立的HPLC指纹图谱能科学全面地反映大叶蛇葡萄的有效部位，可用于大叶蛇葡萄的质量控制。

　　从大叶蛇葡萄中分离出蛇葡萄素，并进行了初步药效学研究，结果表明蛇葡萄素对脱氧皮质酮盐性等高血压模型大鼠有降压作用。为了更好地开发大叶蛇葡萄这一具有湖北地方特色的药材，本课题组对大叶蛇葡萄进行了一系列的研究工作，首先对其进行提取并分别用石油醚、醋酸乙酯萃取，接着通过药理筛选实验发现醋酸乙酯部位提取物具有抗高血压的作用，并首次从中分离并鉴定了一系列黄酮类成分。药理筛选实验及该类化合物的分离鉴定将另文报道。本实验采用RP-HPLC对大叶蛇葡萄的有效部位进行了指纹图谱研究，以期为全面、准确的评价其内在质量，建立质量控制方法提供科学依据。

　　1仪器与试药1.1仪器Waters600E-2996型高效液相色谱仪(含在线氮气脱气，低压四元梯度泵，进样器，柱温箱，二级管阵列检测器)，Empower色谱工作站，电子分析天平(西德Sartorius)，电热恒温水浴锅(北京科学仪器厂)。

　　1.2试剂乙腈(色谱纯，天津市科密欧化学试剂开发中心);水(双蒸水并经0.45μm水系滤膜过滤);其余试剂均为分析纯。

　　1.3对照品蛇葡萄素、花旗松素、槲皮苷、槲皮素、杨梅素均为作者自制，其纯度为96.6%，92.1%，91.4%，99.7%，99.5%。

　　1.4 药材所收集药材经湖北中医学院生药教研室张秀桥副教授鉴定为葡萄科蛇葡萄属植物大叶蛇葡萄A.megalophyllaDielset.Gilg的茎叶。样品采收时间及编号：020528(1)、020720(2)、030318(3)、030614(4)、040417(5)、040523(6)、 040611(7)、040720(8)、040813(9)、050709(10)。

　　2方法与结果2.1色谱条件色谱柱：AgilentTCC18(250mm×4.6mm，5μm);柱温为30℃;流动相：乙腈-0.1%磷酸水，按表1的条件进行梯度洗脱，流速为 1.0ml/min;检测波长：250nm;进样量：5μl。表1流动相梯度条件(略02.2对照品溶液的制备分别取蛇葡萄素、花旗松素、槲皮苷、槲皮素、杨梅素对照品适量，置10ml量瓶中，甲醇超声溶解，经0.45μm滤膜过滤，即得对照品溶液。

　　2.3供试品溶液的制备精密称取干燥至恒重的大叶蛇葡萄粗粉(过二十目筛)20.0g，分别用10倍量的95%，75%乙醇渗漉提取，合并提取液，浓缩，加水分散，分别用石油醚、醋酸乙酯萃取，将醋酸乙酯部位溶液浓缩至干浸膏，甲醇超声溶解，转移至100ml量瓶并稀释至刻度，再从中吸取3ml转移至10ml量瓶，甲醇稀释至刻度，摇匀，经0.45μm滤膜过滤，即得供试品溶液。

　　2.4方法学考察2.4.1精密度实验取同一供试品溶液连续进样5次，进行测定，比较各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果表明各共有指纹相对保留时间稳定，相对峰面积基本一致，RSD<3%。符合指纹图谱的检测要求，表明精密度良好。

　　2.4.2 稳定性实验取同一供试品溶液，分别于0，2，4，8，16，24h进样，进行测定，比较各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果表明各共有指纹相对保留时间稳定，相对峰面积基本一致，RSD<3%。符合指纹图谱的检测要求，表明供试品溶液在24h内基本稳定。

　　2.4.3重现性实验取8号样品5份，分别按照供试品溶液制备方法制备成供试品溶液，然后分别进行测定。结果表明，各共有指纹相对保留时间稳定，相对峰面积基本一致，RSD<3%。符合指纹图谱的检测要求，表明试验方法的重现性良好。

　　2.5 指纹图谱的建立2.5.1指纹图谱的制备方法分别精密吸取供试品溶液5μl注入液相色谱仪，分别按上述色谱条件进行测定，考察120min供试品溶液的分离情况，发现80min之后指纹图谱中基本没有色谱峰出现，故将指纹图谱的洗脱时间初定为80min，见图1。

　　2.5.2共有指纹峰的标定根据10批大叶蛇葡萄有效部位指纹图谱的检测结果，比较其色谱图。标定了共有峰10个，以花旗松素的色谱峰为参照峰(S)，测定了各共有峰的相对保留时间和相对保留面积。结果见表2。表2指纹图谱共有峰相对保留时间/相对峰面积(略)

　　2.5.3共有指纹峰的归属取蛇葡萄素、花旗松素、槲皮素、槲皮苷、杨梅素等对照品溶液，按上述的色谱条件进行测定，对比其保留时间和相应时间位置的色谱峰的紫外光谱情况，确定指纹图谱中的1号峰为蛇葡萄素，5号峰为花旗松素，6号峰为槲皮苷，9号为槲皮素，10号为杨梅素。

　　2.5.4非共有峰面积通过10批大叶蛇葡萄有效部位的供试品测定，统计非共有峰面积占总峰面积的百分比，结果均<5%，符合指纹图谱要求。

　　3讨论比较了多种不同的流动相进行了等度洗脱与不同比例流动相进行梯度洗脱对大叶蛇葡萄指纹图谱的影响，发现等度洗脱得到的色谱峰较少;而采用梯度洗脱，能较全面的反映大叶蛇葡萄的有效部位。因此本实验建立的色谱条件采用梯度洗脱。

　　比较了波长在200～400nm所得的HPLC图谱(DAD检测器检测)，结果表明，检测波长在250nm时，其HPLC图谱中可观测到较多的色谱峰，同时各色谱峰分离效果较好，故检测波长选择250nm。

　　10 批不同采收时间的大叶蛇葡萄指纹图谱中，其主要色谱峰群的整体图貌基本一致，各成分含量的相对比值也无明显差别。因此该指纹图谱可作为湖北地区大叶蛇葡萄有效部位的标准指纹图谱，是评价药材质量和进行质量控制的一个重要依据。但是药材的标准指纹图谱原则上是建立在足够多批次的药材样品基础之上，所以在以后的鉴定过程中，那些经比较获得阳性结果的药材，其色谱信息也纳入统计，从而扩大了药材样品批次，获得了更全面的信息，不断充实和改善了大叶蛇葡萄有效部位的标准指纹图谱，使大叶蛇葡萄药材的质量评价更为科学完善。