激光扫描共焦显微镜的特点与应用

 激光扫描共焦显微镜(LaserScanningConfocalMicroscope，LSCM)是上世纪80年代开始投进实际应用的一种显微设备。与普通光学显微镜相比，LSCM具有更高的分辨率和放大倍率，并可以对观测样品进行分层扫描，实现样品的三维重建和丈量分析;与电子显微镜相比，LSCM可以在亚细胞水平上观察诸如Ca2、pH值和膜电位等生理信号及活细胞形态的实时动态变化。因此，这项产品的面世是显微成像技术发展史中具有划时代意义的重大进展。LSCM在形态学、分子细胞生物学、神经学、药理学、遗传学等生物医学领域，以及材料学、地质学、水利学等产业工程领域有着广泛的应用。根据应用方向的不同，可分为生物用激光扫描共焦显微镜和产业用激光扫描共焦显微镜。

　　一.LSCM的基本原理及结构特点

　　普通光学显微镜使用的卤素灯光源为混合光，光谱范围宽，成像时样品上每个照光点均会受到色差影响以及由照射光引起的散射和衍射的干扰，影响成像质量。而LSCM结构上采用精密共焦空间滤波，形成物象共轭的独特设计，激光经物镜焦平面上针孔形成点光源对样品扫描，于丈量透镜焦平面的探测针孔处经空间滤波后，有效地抑制同焦平面上非丈量光点形成的杂散荧光和样品不同焦平面发射来的干扰荧光。这是由于光学系统物象共轭，只有物镜焦平面上的点经针孔空间滤波才能形成光点图像，扫描后可得到信噪比极高的光学断层图像，分辨率比普通光学显微镜进步1.4倍。LSCM的光源为激光，单色性好，基本消色差，成像聚焦后焦深小，纵向分辨率高，可无损伤地对样品作不同深度的层扫描和荧光强度丈量，不同焦平面的光学切片经三维重建后能得到样品的三维立体结构，这种功能被形象地称为“显微CT”。

　　LSCM由显微镜光学系统，激光光源，扫描装置和检测系统构成，整套仪器由计算机控制，各部件之间的操纵切换都可在计算机操纵平台界面中方便灵活地进行。显微镜是LSCM的主要组件，它关系到系统的成像质量。通常有颠倒和正置两种形式，前者在活细胞检测等生物医学应用中使用更广泛。

　　二.LSCM的生物医学应用

　　LSCM的高灵敏度、高分辨率、高放大倍数，提供了光学显微镜无法显示的结构，使细胞生物学研究上了一个台阶。目前我们可以在亚细胞水平进行动态实验，检测细胞生物质和离子通道的变化，观察细胞在生理、病理和药理情况下对外界因素作用所产生的快速反应，进行定性、定量、定时和定位的分析丈量。最常用的功能是细胞三维重建、细胞荧光检测等。

　　细胞的三维重建

　　普通荧光显微镜分辨率低，显示的图像结构为多层面的图像叠加，结构不够清楚。LSCM能以0.1μm的步距沿轴向对细胞进行分层扫描，得到一组光学切片，经A/D转换后作为二维数组贮存。这些数组通过计算机进行不同的三维重建算法，可作单色或双色图像处理，组合成细胞真实的三维结构。旋转不同角度可观察各侧面的表面形态，也可从不同的断面观察细胞内部结构，丈量细胞的长宽高、体积和断层面积等形态学参数。通过模拟荧光处理算法，可以产生在不同照明角度形成的阴影效果，突出立体感。通过角度旋转和细胞位置变化可产生三维动画效果。LSCM的三维重建广泛用于各类细胞骨架和形态学分析、染色体分析、细胞程序化死亡的观察、细胞内细胞质和细胞器的结构变化的分析和探测等方面。