IF/ICC/IHC试验中可能出现的问题及解决

一．无信号

1. 一抗与二抗不匹配

解决：一抗是在哪个动物物种中生产的，二抗就要选择抗相应物种的（如一抗是用兔生产的，那么应选择抗兔的二抗）。

2. 和目标蛋白结合的一抗量不足

解决：提高一抗和二抗浓度。延长在4oC的孵育时间（如过夜）。

3. 抗体不适用于组织免疫化学试验，在组织免疫化学试验中蛋白质保持天然的3维结构

解决：先用还原免疫蛋白印迹（注意：不是变性蛋白印迹）测试抗体是否可被天然结构的蛋白质识别。

4. 一抗/二抗/扩增试剂盒可能由于保存不当，错误的稀释或多次冻融而失去活性

解决：使用阳性对照确保一抗/二抗正常。

5. 研究的组织中不含目标蛋白

解决：使用抗体供应商建议的阳性对照。

6. 目标蛋白在所研究的组织中表达的量少

解决：增加一步扩增来放大信号。

7. 二抗没有避光保存

解决：避免二抗见光。

8. 脱蜡不充分

解决：延长脱蜡时间，换用新的二甲苯。

9. 固定过程可能屏蔽了抗原决定部位

解决：用抗原修复技术使抗原暴露。缩短固定时间。不充分的固定造成样品边缘很强的染色，但样品中心无信号。

10. 目标蛋白位于细胞核内，以致抗体无法与之结合

解决：在洗涤液和/或抗体稀释液中加入透剂。可以用Tween 20作为透剂，但Triton X100更强。透剂的浓度由切片的厚度决定。

11. PBS缓冲液被可破坏目标蛋白上的磷酸基团的细菌污染

解决：在PBS抗体保存液中加入0.01%的叠氮或使用灭菌不久的PBS。

12．曝光时间太短

解决：延长信号采集时的曝光时间。

二．背景过高

1. 没有封闭或封闭不完全

解决：延长孵育时间和/或提高封闭液中的血清浓度。更换封闭液。我们建议对切片用10%的正常血清封闭1hr，对培养细胞用1-5%的BSA封闭30min。

2. 一抗浓度可能过高

解决：降低一抗浓度。

3. 孵育温度过高

解决：在4oC孵育切片或细胞。

4. 二抗非特异性结合（抗体被破坏）

解决：使用一个无一抗的二级对照。

5. 固定剂残留

解决：在所有步骤之间用TBS或PBS充分洗涤。

6. 内源过氧化物酶有活性

解决：使用酶抑制剂（如使用2mM左旋咪唑抑制碱性磷酸酶，或0.3-3%体积比的过氧化氢抑制过氧化物酶）。

7. 固定过程过强从而改变了抗体能识别的抗原识别部位

解决：改变抗原修复技术，减少与抗原修复液（antigen unmasking solution）的孵育时间。

8. 扩增过度

解决：减少扩增时孵育的时间，并稀释扩增试剂盒。

9. （在用酶检测时）使用了过多的底物

解决：减少底物孵育时间。

10. （在用酶检测时）生色剂与组织或细胞中的PBS反应

解决：在与底物孵育前，用TBS缓冲液洗切片。然后在与底物孵育后用TBS缓冲液洗切片/细胞。

11. 透剂处理破坏了细胞膜并去除了膜蛋白

解决：不在缓冲液中加透剂。

三．非特异性染色

1. 一抗/二抗浓度过高

解决：尝试降低抗体的浓度和/或孵育时间。与不表达目标蛋白的细胞的信号强度对照。

2. 内源性过氧化物酶有活性

解决：使用酶抑制剂（如用2mM左旋咪唑抑制碱性磷酸酶，或0.3-3%体积比的过氧化氢抑制过氧化物酶）。

3. 染色的组织来源于生产一抗的物种（如在小鼠组织上使用小鼠一抗）。当使用二抗时，由于二抗是抗小鼠的，二抗与所有组织都结合。

解决：选择与所研究的组织来源不同的物种生产的抗体。

4. 切片/细胞干了

解决：将切片/细胞保存于高湿度中，不使其干燥。