不能不知的细胞培养的全攻略_细胞传代培养

1. 细胞生长至高密度时，即须分殖至新的培养瓶中，一般稀释比例为1:3 至1:6，依细胞种类而异。

2. 材料：

2.1. 无菌磷酸生理缓冲液(Dulbecco’s phosphate-buffered saline, Ca++/Mg++ free, D-PBS,

GibcoBRL 21600-010)

2.2. trypsin-EDTA solution (0.05% trypsin-0.53mM EDTA-4Na, GibcoBRL25300-062)：

以10 ml 分装于15 ml 无菌离心管中，保存于–20℃，使用前放在37℃ 水槽回温。

2.3. 新鲜培养基

2.4. 无菌吸管/离心管/培养瓶

3. 步骤：

3.1. 附着型胞(adherent cell)

3.1.1. 吸掉旧培养液。

3.1.2. 用D-PBS 洗涤细胞一至二次。

3.1.3. 加入trypsin-EDTA 溶液(1ml/25cm2, 2ml/75cm2)，37 ℃作用数分钟，于倒立显微镜下观察，当细胞将要分离而呈现圆粒状时，吸掉trypsin-EDTA 溶液。(若不移去trypsin-EDTA，则在trypsin-EDTA 作用后，加入适量含血清之新鲜培养基终止trypsin 作用，离心后再吸掉上清液。)

3.1.4. 轻拍培养瓶使细胞自瓶壁脱落，加入适量之新鲜培养基，以吸管上下吸放数次以打散细胞团块，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，以正常培养条件培养。

3.2. 悬浮型细胞(suspension cell)

3.2.1. 吸出细胞培养液，放入离心管中，离心1000 rpm 5 分钟。

3.2.2. 吸掉上清液，加入适量之新鲜培养基，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，以正常培养条件培养。

3.3. 融合瘤(hybridoma)

3.3.1. 有些hybridoma cell 需培养三天以上才会产生抗体，若是更换培养基，则可能会失去抗体。因此继代培养不需离心后更换培养基，直接添加新鲜培养基稀释细胞浓度即可。若体积太大，可倾斜放置，或分殖至新培养瓶中。