双抗夹心法ELISA实验

　　实验步骤1. 包被捕获抗体

　　1) 用碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液 (pH 7.4) 稀释捕获抗体至浓度 1-10 μg/ml，包被酶标板。

　　2) 封口膜覆盖酶标板，于 4 °C 孵育过夜。

　　3) 倒掉包被液，用磷 PBS 洗板 2 次，每孔 200 μl。在水池上轻甩倒掉洗液，在纸巾上轻拍酶标板除去残留液体。

　　2. 封闭和加样品

　　1) 封闭包被后孔内残留的蛋白结合位点,每孔加 200 μl 含 5% 脱脂奶粉的 PBS 的封闭液。

　　2) 封口膜覆盖酶标板，室温孵育至少 1-2 小时，或者方便的话 4 °C 孵育过夜。

　　3) 每孔加 100 μl 适当稀释的样品。在精确定量测定时，通常将未知浓度样品与标准曲线相比较，每块板都要做标准(做两份或者三份)和空白对照以保证精确性。37 °C 孵育 90 分钟。

　　4) 倒掉样品，PBS 洗板 2 次，每孔用 200 μl。

　　3. 用检测抗体和二抗先后进行孵育

　　1) 每孔加入 100 μl 稀释好的检测抗体。

　　2) 封口膜覆盖酶标板，室温孵育 2 小时。

　　3) PBS 洗板 4 次。

　　4) 加入标记二抗，每孔 100 μl，使用前用封闭液快速稀释至最佳浓度(参照使用手册)。

　　5) 封口膜覆盖酶标板,室温孵育 1-2 小时。

　　6) PBS 洗板 4 次。

　　4. 检测

　　使用多通道移液器加入底物溶液，每孔 100 μl(或 50 μl)。