今日支招-质体DNA的小量分离法
发布日期：2014-03-19 来源：网络
这个实验是以alkaline lysis的方法进行，其原理是将细菌以NaOH及SDS分解，并使蛋白质及DNA变性，继的以酸中和。在此情况下，小分子质体DNA在中和后可恢復原态，但大部份的细菌染色体DNA则无法完全復原而与 SDS-K+ 所形成的复合物一起沉淀下，可以离心去除的，上清液中所含的质体则可以酒精或異丙醇将其沉淀下來。
仪器用具：
微量离心机；冰浴
药品试剂：
MP I (25 mM Tris-HCl, pH 8.0; 10 mM EDTA, pH 8.0; 50 mM glucose)
MP II 新鲜配制 (0.2 N NaOH; 1% SDS; 使用前以10 N NaOH, 10% SDS稀释混合配制)
MP III (3 M 醋酸钾溶液，pH 5.2，置冰浴中)
RNase A (1 mg/mL, 已经过100℃加热30 min 以去除DNase 活性)
纯酒精及70%酒精
TE-8.0 (10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA, pH 8.0)
方法步骤：
1) pBlueGus/JM109, pQE31/JM109 接种于含100 μg/mL ampicillin 的LB 培养基，于37℃震荡培养过夜。
2) 取1.5 mL 菌液，加于微量离心管中，以6,000 rpm 离心2 min 后，倒去上清，以微量移液器头尽可能吸去残留液体。
◆ 两种质体均请制备三管！
3) 沉淀加入0.1 mL MP I，剧烈震荡，将沉淀完全打散。
4) 慢慢加入0.2 mL MP II，盖上管盖后将管子反复上下摇动，注意不可震荡！ 此时溶液应渐澄清且黏度增加；将离心管置冰浴中。
5) 加入0.15 mL MP III，混合均匀，亦不可剧烈震荡，置冰浴中5 min。
6) 以12,000 rpm 离心5 min。
7) 小心吸出上清至另一离心管，加入2 倍体积的纯酒精 (或0.6 倍体积的isopropanol)，混合均匀，置室温2 min。
8) 以12,000 rpm 离心10 min。倒去上清液，沉淀以70%酒精洗二次，每次各离心1 min。
◆ 小心不要把沉淀也倒掉了！
9) 倒去上清液后，将离心管置回离心机，短暂离心后取出，以微量移液器头尽可能吸去残留液体。将管盖打开，置室温中让沉淀干燥。待沉淀干燥后，以30 μL TE-8.0 溶解 (可以微量移液器头反复缓慢吸放溶液，以助溶解)。
10) 加入1 μL RNase A。
11) 进行限制酶切割、电泳分析等实验。
(本文来源：网络 责任编辑：expert)
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