酸性磷酸酶的显示方法及操作过程

　　一、实验目的

　　1. 掌握Comori 法的基本原理和方法。

　　2. 观察酸性磷酸酶在细胞内的分布状况。

　　二、实验原理

　　酸性磷酸酶能分解磷酸脂而释放出磷酸基，在PH5.0 的环境中，磷酸基能与铅盐反应形成磷酸铅。但因其是无色的，所以再经过与硫化铵作用，形成棕黑色的硫化铅沉淀，由此就能显示酸性璃酸酶在细胞内的存在与分布。

　　本实验的技术特点是：①用冷冻涂片和中性福尔马林固定，可避免在固定、包埋及制片过程中酶的失活，保证了实验的稳定性。②采用较短的作用时间，可避免细胞质内其它蛋白质及核内出现阳性假象，保证了实验的可靠性。③以姬姆萨染色的巨噬细胞为观察对象，细胞核及细胞轮廓以及细胞质中反应沉淀的颗粒都比较清晰，有助于深入理解细胞吞噬作用、浴酶体功能和分布以及溶酶体标志酶——酸性磷酸酶的性质。

　　三、实验用品

　　(一)材料小鼠腹腔液涂片(重点观察巨噬细胞)

　　(二)器材高压灭菌锅、冰箱、注射器、载玻片、盖玻片及温箱。

　　(三)试剂

　　1. 10%中性福尔马林(pH6.8～7.2)

　　甲醛 10ml

　　醋酸钠 2g

　　蒸馏水 90ml

　　2. 酸性磷酸酶作用液

　　蒸馏水 90ml

　　0.2mol/L 醋酸缓冲液(pH4.6) 12ml

　　5%硝酸铅 2ml

　　3.2%β-甘油磷酸钠 4ml

　　先将蒸馏水和醋酸缓冲液混合，随后分成大致相等的两份，一份中加醋酸铅溶液，另—份加甘油磷酸钠溶液，然后再将两者缓缓混合，边混匀边搅匀。若PH<5.0，可加少量醋酸调节。临用前配制。配好后的作用液应透明无絮状悬浮物和沉淀，否则将严重影响实验结果。

　　3. 1%硫胺溶液

　　硫化胺 1ml

　　蒸溜水 9ml

　　4. 姬姆萨染液(1:30)

　　365教育装备采购网姬姆萨原液 3 滴

　　磷酸盐缓冲液(PH6.8) 5ml

　　5. 3%淀粉肉汤

　　牛肉膏 0.3g

　　蛋白胨 1.0g

　　氯化钠 0.5g

　　蒸馏水 100ml

　　高压灭菌9.9×104Pa(15 磅)20min，再加入可溶性淀粉6g，60～80℃水浴溶

　　解后，4℃冰箱保存备用。

　　四、实验操作

　　1. 取小白鼠1 只、每日腹腔注射6%淀粉肉汤1m1，连续注射3 天。

　　2. 第3 天注射后3～4h，脱颈处死小鼠，打开腹部皮肤，暴露腹膜，再向腹腔内注射生理盐水2ml，过3min 后在原注射部位抽取腹腔液0.1～0.2ml。

　　3. 将腹腔液滴在预冷的载玻片上，每片1～2 滴。将玻片垂直插入玻片架，迅速放到冰箱内(4℃)，让细胞自行铺展。

　　4. 30min 后，将玻片转入10%中性福尔马林，4℃冰箱内固定30min。

　　5. 自来水漂洗5min，把水沥干。

　　6. 转入酸性磷酸酶作用液中，37℃处理30min。

　　7. 自来水漂洗片刻。

　　8. 1%硫化胺处理3～5 min。

　　9. 自来水冲洗，甩干。

　　10. 用1:30 的姬姆萨染液染色15min。

　　11. 自来水冲去染液，用磷酸盐缓冲液临时封片，镜检。

　　12. 对照实验

　　将第3 步的腹腔液涂片置50℃温箱中处理30min，使酶失活，再进行6～11

　　步的同样实验。

　　五、实验结果

　　在巨噬细胞的细胞质中，出现许多棕色或棕黑色的颗粒和班块。部分细胞内，酸性磷酸酶极为丰富，整个细胞质区域都有黑色沉淀。中性粒细胞呈现阴性反应。