碱裂解法提取质粒DNA

　　实验目的

　　1、掌握最常用的提取质粒DNA的方法和检测方法;

　　2、了解制备原理及各种试剂的作用。

　　实验原理 碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢DNA键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc/KAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

　　细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。

　　质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA

　　一、材料

　　含pUC19质粒的大肠杆菌，1.5ml塑料离心管, 离心管架，枪头及盒、卫生纸。

　　二、设备

　　微量移液器(20μl,200μl,1000μl)， 台式高速离心机，恒温振荡摇床， 高压蒸汽消毒器(灭菌锅)， 涡旋振荡器，恒温水浴锅，双蒸水器，冰箱，等。

　　三、试剂准备

　　1、 LB液体培养基：称取蛋白胨(Tryptone)10g，酵母提取物(Yeast extract) 5g，NaCl 10g，溶于800ml蒸馏水中，用NaOH调pH至7.5，加水至总体积1升，高压下蒸气灭菌15分钟。

　　2. 氨苄青霉素(Ampicillin,Amp)母液：配成 100mg/ml水溶液，-20℃保存备用。

　　3. 溶液Ⅰ：50mM葡萄糖，25mMTris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0)。

　　配制方法：1M Tris-HCl(pH 8.0)12.5ml，0.5M EDTA(pH 8.0)10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。在121℃高压灭菌15min ，贮存于4℃。

　　4. 溶液Ⅱ：0.2M NaOH，1% SDS。

　　配制方法：2M NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。使用前临时配置。

　　5. 溶液Ⅲ：醋酸钾(KAc)缓冲液，pH 4.8。

　　配制方法：5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddH2O至500ml。4℃保存备用。

　　6. 苯酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)。氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开，异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应戴手套。【生物秀 www.bbioo.com】

　　7. 无水乙醇;

　　8. 70%乙醇;

　　9http://jyzb.cago365.com. TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。

　　配制方法：1M Tris-HCl(pH 8.0)1ml，0.5M EDTA(pH 8.0)0.2ml，加ddH2O至100ml。121℃高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。

　　1M Tris Cl(Tris(三羟甲基)氨基甲烷)：800mlH2O中溶解 121g Tris碱，用浓盐酸调pH值，混匀后加水到1L;

　　0.5MEDTA(乙二胺四乙酸)：700ml H2O中溶解186.1g Na2EDTA.2H2O，用10M NaOH调 pH8.0(需约50ml)，补H2O到 1L。

　　10. RNA酶A母液：将RNA酶A溶于10mmol/LTris·Cl(pH7.5), 15mmol/L NaCl中，配成10mg/ml的溶液，于100℃加热15分钟，使混有的DNA酶失活。冷却后用1.5mleppendorf管分装成小份保存于-20℃。

　　四、操作步骤

　　1. 挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于20ml LB(含Amp100ug/ml)液体培养基中，37℃、250rmp振荡培养过夜(约12-14hr)。

　　2. 取1.5ml培养液倒入1.5mleppendorf管中，12000rmp离心1-2min。弃上清，将离心管倒置于卫生纸上，使液体尽可能流尽。

　　3、菌体沉淀重悬浮于100μl溶液Ⅰ中(需剧烈振荡，使菌体分散混匀。),室温下放置5-10 min。

　　4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl，盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管数次，以混匀内容物(千万不要振荡)，冰浴5 min，使细胞膜裂解(溶液Ⅱ为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清)。

　　5、加入150μl预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置5min。 12000rmp离心10min。溶液Ⅲ为中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀。

　　6、上清液移入干净eppendorf管中，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀,12000rmp离心10min。(450μl的苯酚/氯仿/异戊醇。)

　　7、小心移出上清于一新微量离心管中，加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀，室温放置 2-5min，离心12000rmp×10min。

　　8、弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出，加入1ml 70%乙醇洗沉淀一次，12000rmp离心5 min。

　　9、 吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，室温干燥。

　　10、将沉淀溶于20μl TE缓冲液(pH8.0，含20μg /ml RnaseA，约4μl)中，37℃水浴30min以降解RNA分子，储于-20℃冰箱中。

　　五 实验结果：

　　注意事项

　　1. 提取过程应尽量保持低温。

　　2. 沉淀DNA通常使用冰乙醇，在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀完全。沉淀DNA也可用异丙醇(一般使用等体积)，且沉淀完全，速度快，但常把盐沉淀下来，所以多数还是用乙醇。