ELISA直接法测长叶车前花叶病毒

　　ELISA直接法测长叶车前花叶病毒(RMV)含量实验步骤

　　1. 将不同浓度的待检测RMV溶液作为样品液，在测定板每孔各加250ul,至冰箱(4℃)中孵育过夜。

　　2. 孵育后，去除孔穴内抗原溶液，用PBS-Tween20溶液缓缓冲洗孔穴3次，每次3min，然后去净洗涤液。

　　3. 每孔穴加250ulRMV的酶标记抗体溶液(用1%牛血清白蛋白的PBS- ween20稀释)在恒温箱(37℃)里孵育3-6h,或6℃下过夜。

　　4. 去除孔穴酶标记抗体溶液，用PBS-Tween20溶液缓缓冲洗3次每次3min，然后去净洗涤液。

　　5. 每孔穴加入新鲜配备的底物溶液250ul,室温放置0.5h，或者放置出现黄色。

　　6. 加入50ul3N NaOH，终止反应。

　　7. 对每孔穴的黄色溶液，测定449nm波长处的吸光值。

　　讨论

　　1. 如该聚苯乙烯塑料微量反应板第一次使用，应分别用标准浓度的RMV溶液、RMV的抗血清及RMV与它的IgG形成的免疫结合物，进行期盼滴定法来测该聚苯乙烯塑料微量反应板对RMV抗原和它的抗体的吸附能力。

　　2. 在正式测样品前，用0.1mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液配置各种标准浓度的RMV溶液，依照实验步骤测定RMV各种标准浓度的A449nm值，以病毒标准浓度为横坐标，A449nm值为纵坐标绘制标准曲线，由此可以测出RMV包被的最适合浓度。

　　3. 测出原始底物的吸光值，以便核准数据。

　　4. 对照标准曲线，就可算出样品液中RMV的含量。

　　5. 如无牛血清白蛋白，可用0.1%白明胶代替。

　　6. 对于不稳定的病毒，用中性缓冲液稀释。

　　7. 如有ELISA测定仪，可快速测定。

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