胡萝卜根离体培养实验

　　实验材料 市售大而新鲜的胡萝卜

　　试剂、试剂盒 1. MS 培养基 10 mg/L2,4-D 2 mg/L 6-BA 2. 70% 乙醇3. 0.1% 升

　　仪器、耗材 1. 超净工作台2. 灭菌锅3. 显微镜4. 接种器械5. 不锈钢打孔器6. 烧杯( 500ml )7. 培养皿( 9cm )8. 移液管

　　实验步骤

　　1. 将胡萝卜用自来水冲洗干净，用刮皮刀除去表皮 1-2mm ，横切成大约 10-40mm 厚的切片。以下步骤全部无菌操作。

　　2. 胡萝卜片经 70% 乙醇处理 30-60 秒后，无菌水冲洗一遍，再用 0.1% 升汞或饱和漂白粉溶液浸泡 10 分钟，无菌水冲洗 3-5 次。

　　3. 将胡萝卜片平放于培养皿中，一手用镊子固定胡萝卜片，一手用打孔器按平行于组织片垂直轴方向打孔。每个孔应打在靠近维管形成层的区域，务必打穿组织。然后从组织片中抽出打孔器，用玻棒轻轻将圆柱体从打孔器中推出，放到无菌水的培养皿中。重复打孔步骤，直至制备足够数量的组织圆柱体。

　　4. 用镊子取出 1-2 条胡萝卜圆柱体，放入另一含无菌水的培养皿中，用刀片切除圆柱体两端各 2mm 长的组织。将剩下的组织切成厚约 2mm 的小圆片。在整个切割操作中要多次火焰消毒镊子和解剖刀，冷却后再使用。

　　5. 用镊子将圆片转到灭菌的滤纸上(每次一片)，将圆片两面的水分吸干，并立即接种到培养基表面。每瓶接种 6-8 片。注意：接种时使三角瓶呈一定的倾斜度，用手拿镊子、灼烧等整个接种过程不要直接在培养基上方完成，以减少污染机会。

　　6. 将培养物置于 25℃温箱中培养。可将一部分放在光下培养，一部分放在暗中培养，比较光下和暗处对诱导愈伤组织的反应。

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