Folin 一酚法测定蛋白质含量的原理

　　一、目的

　　掌握 Folin 一酚法测定蛋白质含量的原理方法，熟悉分光光度计的操作。

　　二、原理

　　Folin 一酚法测定蛋白质含量的过程包括两步反应：第一步是在碱性条件下蛋白质与 Cu 2 +

　　作用生成络合物，第二步是此络合物还原 Folin

　　试剂(磷钼酸和磷钨酸试剂)，生成深蓝色的化合物，且颜色深浅与蛋白质的含量成正比关系。该方法灵敏度高于双缩脲法

　　100 倍。硫酸铵、甘氨酸、还原剂如二硫苏糖醇( DTT )、巯基乙醇等会干扰反应。

　　三、仪器与试剂

　　1 .仪器

　　( 1) 分光光度计

　　( 2 )水浴

　　( 3 )试管

　　( 4 )具塞试管 8 支

　　( 5 )小烧杯 2 支

　　( 6 )漏斗及架

　　( 7 )分析天平

　　( 8 )吸管： 0 . 5m1 X 1 ， 1m1X2 ， 5m1 X 1

　　( 9 )容量瓶： 100m1 X 2 ， loml X 1

　　( 10 )滤纸、玻棒等

　　( 11) 研钵

　　( 12 )离心机、离心管

　　2 .试剂

　　( 1 ) 0.5mol/ L NaOH

　　(2) 试剂甲

　　1) 称取 1Og Na2C03 , 2gNaOH 和 0.25g 酒石酸钾钠，溶解后用蒸馏水定容至

　　500m1 。

　　2) 0. 5g 硫酸铜 (CuS0 4 ? 5H 2 O) 溶解后，用蒸馏水定容至 100m1 。

　　每次使用前将 A 液 50 份与 B 液 1 份混合，即为试剂甲。此混合液的有效期

　　只有 1 天，过期失效。

　　(3) 试剂乙：在 1.5L 容积的磨口回流器中加入 100g 钨酸钠 ( Na 2 WO 4 .2H 2 0

　　)， 25g 钼酸钠( Na 2 Mo 4 .2H 2 0 )及 700m1 蒸馏水，再加 50m1 85

　　%磷酸， 100m1 浓盐酸充分混合，接上回流冷凝管，以小火回流 10h, 回流结束后，加入 150g 硫酸锂，

　　50ml 蒸馏水和数滴液体溴，开口继续沸腾 15min

　　，驱除过量的溴，冷却后溶液呈黄色(若仍呈绿色，须再重复滴加液体溴数滴，再继续沸腾 15min )。然后稀释至

　　1L ，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时大约加水 1 倍，使最终浓度相当于 1 mol / L 盐酸。

　　3 .材料

　　绿豆芽或其他植物材料。

　　四、操作步骤

　　1 .标准曲线的绘制

　　(1) 配置标准牛血清白蛋白溶液：在分析天平上精确称取 0.025g

　　结晶牛血清白蛋白，倒至小烧杯内，加入小量蒸馏水溶解后转入 100m1

　　容量瓶中，烧杯内的残液用少量蒸馏水冲洗数次，冲洗液一并倒入容量瓶内，最后用蒸馏水定容至刻度，配制成标准蛋自质溶液，其中牛血清白蛋白的浓度为

　　250 ug/ ml 。

　　(2) 系列标准牛血清白蛋白溶液的配制：取具塞试管 6

　　支，按下表加入牛血清白蛋白标准溶液及蒸馏水。然后各管加入试剂甲 5ml ，混合后在室温下放置 10min ，再加

　　0.5ml 试剂乙，立即混合均匀(这一步速度要快，否则会使显色程度减弱)。 30min 后，以不含蛋白质的 1

　　号试管为对照，与其他 5 支试管内的溶液依次用分光光度计于 5OOnm 波长下比色。记录各试管内溶液的吸光度。

　　试剂 1 2 3 4 5 6

　　250ug/mg 牛血清蛋白( ml ) 0 0.2 0.40.6 0.8 1.0

　　H 2 O (ml) 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0

　　蛋白质含量( ug ) 0 50 100 150 200 250

　　(3) 标准曲线的绘制：以吸光度为纵标，以牛血清自蛋白含量( ug )为横坐标，绘制标准曲线。

　　2 .样品测定

　　( 1) 称取绿豆芽下胚轴 1g 于研钵中，加蒸馏水 2m1, 匀浆。转入离心管，并用 6m1

　　蒸馏水分次洗涤研钵，并入离心管。 4000r/min 离心 20min. 弃去沉淀，上清液转入容量瓶，定容至

　　10m1.

　　(2) 取具塞试管 2 支，各加入上清液 lml, 分别加入试剂甲 5m1, 混匀后放置 lomin

　　，然后加试剂乙 0.5 ml ，迅速混匀，室温下放置 30min ，于 500nm 波长下比色，记录吸光值。

　　五、结果处理

　　从标准曲线上查出测定液中蛋白质的含量 X ( ug )，然后计算样品中蛋白质的百分含量。

　　六、注意事项

　　Folin 试剂(试剂乙)在碱性条件下不稳定，但此实验中反应在 pH 10 时发生，因此在 Folin

　　试剂反应时应立即混匀，否则显色程度减弱。