动物线粒体DNA提取试剂注意事项

　　线粒体DNA(mtDNA)是进行分子进化研究和母性遗传研究的重要材料，但传统的两步式mtDNA提取方法是先温和裂解细胞，分离线粒体，然后再从线粒体中提取mtDNA。此方法中的温和裂解细胞的条件十分难以控制，需要针对不同组织材料单独进行优化。本方法克服了上述缺点，具有下列优点：

　　1. 不需要单独纯化线粒体，柱式法纯化，操作简单快捷。

　　2. 得到的mtDNA可以直接用于PCR和酶切。

　　3. 每107个动物细胞一般能得到100ng左右的mtDNA，每克组织一般能得到3-5 ug mtDNA。

　　4. 注意：本产品只适合于动物材料，不适合于植物材料，因为植物线粒体DNA一般都十分巨大，非常难提。

　　成 份 50次包装

　　溶液A13 mL

　　溶液B13 mL

　　溶液C18 mL

　　离心吸附柱50 套

　　通用洗柱液50 mL

　　DNA洗脱液10 mL

　　使用手册1份

　　常温运输，短期可以在室温放置;长期保存最好放4℃。

　　无

　　一：培养细胞预处理

　　1. 用自备的0.25%胰酶消化液处理约107个培养细胞，离心收集后弃上清。

　　2. 用PBS或TBS等缓冲液洗涤细胞两次，离心得到的细胞沉淀直接用于mtDNA提取。

　　二：组织细胞预处理

　　3. 用剪刀将1g新鲜的动物组织剪碎(芝麻大小最好)，转移到1.5mL塑料离心管中，用于mtDNA提取。注意：最好不要使用冻存的动物组织，因为冻凝过程中形成的冰晶会将线粒体刺破，使其DNA释放出来被胞浆中的DNA酶降解，影响回收率。

　　三：血液预处理

　　4. 将3-5 mL抗凝外周血静置30分钟或低速离心5分钟，取白细胞层。

　　5. 用自备PBS洗涤白细胞两次，得到的白细胞沉淀用于mtDNA提取。

　　四：mtDNA提取

　　5. 在细胞沉淀或剪碎的组织中加入250 uL冰浴的溶液A，充分吹打分散。如果是剪碎的组织，不要等成块的组织溶解即可继续下步操作。

　　6. 加入250 uL常温的溶液B(如果溶液B有沉淀，用前须37℃加热溶解后冷却到室温方可使用)，温和反复颠倒混匀10次。千万不要剧烈振荡。

　　7. 冰上放置6-8分钟。注意不要超过8分钟。

　　8. 加入350 uL冰浴的溶液C，温和混匀4-6次，可见白色沉淀物产生，然后放冰上放置20-25分钟。

　　9. 室温12000-15000 g离心10分钟，小心将上清液转移到离心吸附柱中。由于此时的溶液比重较大，有时候出现沉淀漂浮是正常现象，取上清时避开漂浮的沉淀即可。

　　10. 静置5分钟以让DNA与离心吸附柱充分结合，此步十分重要。

　　11. 室温12000-15000 g离心1分钟，弃收集管中的废液。

　　12. 加入500 uL的通用洗柱液，室温12000-15000 g离心1分钟，弃收集管中废液。注意：通用洗柱液中含乙醇，用后需要将盖拧紧存放，否则乙醇会挥发。

　　13. 重复上步1次。

　　14. 室温12000-15000 g离心1分钟，甩干残留液体。此步不能省略，否则残留乙醇会影响DNA的后续使用(如DNA上样时不能沉淀到加样孔中)。

　　15. 将离心吸附柱置于一个新的1.5 mL塑料离心管中，加入30-50 uL 65-80℃预热的DNA洗脱液，室温放置2分钟。常温的DNA洗脱液也可以用于洗脱，但产量稍微有所降低。

　　16. 室温12000-15000 g离心1分钟，离心管底溶液即mtDNA。

　　17. 由于本公司离心吸附柱结合DNA能力较强，如果再加30-50 uL DNA洗脱液到离心吸附柱中，往往还能洗脱下很多mtDNA(相当于第一次洗脱的20-30%)，但注意不要使用上步得到的mtDNA溶液来洗脱。

　　18. 12000-15000 g离心1分钟，离心管底溶液即线粒体DNA。每107个动物细胞一般能得到100ng左右的mtDNA，每克组织一般能得到3-5 ug mtDNA。如果DNA需要浓缩，可以使用本公司的核酸浓缩剂。

　　19. 由于DNA机械断裂，电泳时DNA可能不呈现专一的带，但此mtDNA溶液可以直接用于PCR。

　　线粒体

　　线粒体是合成ATP和脂肪酸的细胞器，每个细胞有多个线粒体，每个线粒体有多个线粒体基因组，例如每个酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞里有20多个线粒体，人淋巴细胞有数个，肝细胞有500-2500个，卵母细胞有上千个。除少数低等真核生物线粒体基因组为线状DNA外，其他生物的线粒体基因组都是环状DNA。线粒体基因组缺乏组蛋白，故无核小体。哺乳动物的线粒体基因DNA没有内含子，几乎每一对核苷酸都参与一个基因的组成，有许多基因的序列是重叠的。不同物种的线粒体基因组的大小相差悬殊，在动物中的趋势是物种越高等，mtDNA越小。常见物种mtDNA的大小列表：

　　物种mtDNA大小(KB)例子

　　脊椎动物15.7-17.5小鼠为16,295bp;

　　人类为16,569bp

　　昆虫14.5-17.9

　　原虫18.5-40.0

　　真菌18.9-95.0酵母为75Kb，曲霉为32Kb

　　藻类15.0-18.0

　　高等植物120-2700玉米mtDNA为600 Kb

　　人mtDNA只有D环区(D-loop，参与复制启动)和另外87个bp不是编码基因外，其余序列共编码13个蛋白质(细胞色素b、细胞色素氧化酶的3个亚基、ATP酶的2个亚基以及NADH脱氢酶的7个亚基)、24个rRNA(包括1个16SrRNA、1个12SrRNA和22个tRNA)。人类的神经肌肉变性疾病如Leber氏遗传性视神经病、帕金森病、早老痴呆症、线粒体脑肌病、母系遗传的糖尿病和耳聋等都同线粒体基因有关。与细胞核DNA相比，mtDNA具有下列特点：①突变率高，是核DNA的10-100倍左右，有利于检查出在较短时期内基因发生的变化，有利于比较不同物种的相同基因之间的差别，确定这些物种在进化上的亲缘关系;②母性遗传(maternal inheritance)，这是由于动物精子的细胞质极少，子代mtDNA基本上都是来自卵细胞，因此具有相同mtDNA序列的个体必定是来自一位共同的雌性祖先。